Ben Stiller volta nesta sequência do filme de 2006, Uma Noite no Museu no papel de Larry Daley, cargo de guarda-noturno no Museu de História Natural, em Nova York. Mas desta vez a ação se dá no museu Smithsonian de Washington, na capital dos Estados Unidos, onde ganham vida personalidades da história americana - entre eles presidentes, Amelia Earhart (Amy Adams), uma das pioneiras da aviação; além de um improvável faraó, Kah Mun Rah (Hank Azaria).